隨著單細胞測序（single-cell sequencing）技術逐漸應用于科研，臨床和制藥的研究中，每個月平均發(fā)表的相關文章高達100多篇，那么在單細胞測序應用最多的腫瘤領域，各位專家都是怎么用這個技術在相關領域深入探究的呢？我們選取了部分文章，來和大家一起了解一下。

第一篇 解析腫瘤藥物毒副作用機制

文章標題：Intermittent PI3Kδ inhibition sustains anti-tumour immunity and curbs irAEs
發(fā)表期刊：Nature
DOI：10.1038/s41586-022-04685-2

這項研究的主要目的是了解PI3Kδ抑制劑的免疫系統(tǒng)相關毒副作用的深層機制。

為了分析PI3Kδ抑制劑對腫瘤微環(huán)境的影響，作者首先收集PI3Kδ抑制劑實體瘤臨床試驗中的患者樣本，進行了全腫瘤RNA測序、免疫組化及腫瘤浸潤CD8+T細胞的RNA測序，發(fā)現(xiàn)PI3Kδ抑制劑可以改變腫瘤微環(huán)境。

接下來，作者通過小鼠實體瘤模型，進一步分析PI3Kδ抑制劑副作用的機制。作者檢測了小鼠不同器官中Treg的水平，發(fā)現(xiàn)脾臟和腸道中Treg水平均明顯下降。

由于患者中的藥物毒副作用在消化道中表現(xiàn)最為嚴重，因此作者推測腸道中的Treg可能對PI3Kδ抑制劑最敏感。為檢驗這一假設，作者對患者的腫瘤浸潤T細胞和小鼠模型的消化道Treg細胞進行了單細胞測序，發(fā)現(xiàn)腸道中特定Treg亞群對PI3Kδ抑制劑高度敏感。PI3Kδ抑制劑用藥后，由于失去了Treg的調(diào)控，機體引起腸炎。

為了進一步確定PI3Kδ抑制劑與腸炎的關系，作者建立了小鼠模型，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，給藥組小鼠腸炎更為嚴重。

最后，作者探索了如何通過調(diào)整給藥頻次來降低毒副作用。作者測試了持續(xù)給藥和間歇給藥兩種方式，發(fā)現(xiàn)間歇給藥可以在一定程度上降低毒副作用，為臨床用藥提供了可能的改進方法。

這篇文章用單細胞測序結合了bulk RNA seq、免疫組化、動物模型等多種方法，為分析PI3Kδ抑制劑的毒副作用機制提供了多個層面的證據(jù)。同時，在單細胞測序方面，作者不僅進行了臨床樣本的單細胞測序，也對小鼠模型樣本進行單細胞測序分析，使得研究能夠兼顧臨床證據(jù)和深入的機制分析。最后，作者還探索并驗證了解決毒副作用問題的可能方法，做到了研究“從臨床中來，到臨床中去”，進一步提升了研究的臨床價值。

第二篇 分析腫瘤免疫微環(huán)境

文章標題：Extricating human tumour immune alterations from tissue inflammation
發(fā)表期刊：Nature
DOI：10.1038/s41586-022-04718-w

這項研究探討的的是癌細胞“策反”T細胞，保護實體瘤免受免疫攻擊。

作者收集了非惡性的口腔炎癥組織，以及頭頸鱗癌患者的腫瘤組織和外周血樣本，對其中的T細胞和抗原提呈細胞進行了流式分析和高通量單細胞測序。
這么一來，作者發(fā)現(xiàn)，雖然腫瘤組織中的大多數(shù)免疫細胞在非惡性的炎癥組織中也都存在，但一種特殊的Treg細胞，是腫瘤組織所獨有的。
這種Treg細胞具有比一般Treg細胞更強的免疫抑制能力，可以保護腫瘤組織中的癌細胞，讓癌細胞免遭其它免疫細胞的攻擊。
相比其它Treg細胞，這種Treg細胞的特征是會表達同時表達ICOS受體和IL1R1受體——一般的Treg細胞基本不會同時表達這兩種受體，因此可以用這兩種受體作為標志物，篩選出這種特殊的Treg細胞。
最后，作者還通過單細胞公共數(shù)據(jù)集，確定這種Treg細胞不僅僅在頭頸鱗癌中有，在其它實體瘤中也有存在——這也許會成為未來實體瘤治療的突破點。

這篇文章的思路很巧妙，研究的是惡性腫瘤中浸潤的免疫細胞，而其對照用的是非惡性的炎癥組織——很多其它的腫瘤單細胞測序研究往往會用癌旁或者正常組織作為對照，這篇文章的對照選擇無疑為我們拓展了新的思路，為從一般炎癥相關模式中提取疾病特異性變化提供了可參考的優(yōu)秀實例。

同時，作者也采用了多種研究手段，除單細胞測序外，還有流式分析、體外免疫刺激和免疫抑制實驗、細胞因子分析、人源化小鼠模型等方法，這讓文章?lián)碛辛烁鱾€不同層面和角度的證據(jù)，豐富全面。而且，文章最后還把重點發(fā)現(xiàn)拓展到了其它實體瘤中，進一步提升了其發(fā)現(xiàn)的生物學意義。

第三篇 理解癌癥發(fā)生機制

文章標題：Single-cell analyses define a continuum of cell state and composition changes in the malignant transformation of polyps to colorectal cancer
發(fā)表期刊：Nature Genetics
DOI：10.1038/s41588-022-01088-x

這項研究關注從健康結腸到浸潤性結直腸癌過程中的癌癥發(fā)生機制。因此，作者對健康結腸、腺瘤性息肉和結直腸癌樣本分別進行了snRNA-seq（單細胞核轉錄組測序）和scATAC-seq（單細胞ATAC測序），繪制了腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的基因表達調(diào)控和轉錄組變化。

首先，作者對不同類型樣本中的細胞類型進行了分析，發(fā)現(xiàn)Treg細胞在腸息肉和結直腸癌中均有富集，但僅結直腸癌樣本中存在耗竭T細胞富集。

同時，腸息肉和結直腸癌中還存在著非常不同的成纖維細胞亞型，可能在癌前病變的腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用。

研究人員還發(fā)現(xiàn)，腸息肉和結直腸癌樣本中的上皮細胞里富含干細胞樣上皮細胞，這是健康腸道樣本里所沒有的，作者認為這些干細胞樣上皮細胞可能代表著組織中的“癌癥”干細胞。隨著疾病惡性程度的加深，樣本中干細胞的比例也逐漸增大。

隨后，作者將腸息肉和結直腸癌樣本中的干細胞樣細胞與正常干細胞的基因表達和染色質可及性進行比較，發(fā)現(xiàn)干細胞樣細胞和正常干細胞間的差異隨著細胞惡性程度的增加而增加。同時還發(fā)現(xiàn)了一系列表達隨細胞惡性程度加深而變化的基因，如ASCL2, HNF4A, GPX2等。

最后，作者結合TCGA中的正常樣本和結直腸癌樣本甲基化數(shù)據(jù)，對單細胞測序數(shù)據(jù)進行了更為深入的挖掘，揭示了具有早期染色質可及性變化的結直腸癌甲基化位點。

這是一篇以單細胞測序及其分析為主的文章，不涉及任何濕實驗驗證。但這并不影響這篇文章的內(nèi)容豐富程度——它利用單細胞多組學技術，輔以大量深入的生信分析，從轉錄組和表觀遺傳調(diào)控兩個層面對數(shù)據(jù)進行了深入挖掘，對細胞亞群、功能機制，以及癌前病變的進展過程，都提出了很有意義的洞見。同時，和TCGA甲基化測序數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析，進一步拓展了文章的視角和深度。

第四篇 挖掘腫瘤浸潤淋巴細胞特征

文章標題：An activation to memory differentiation trajectory of tumor-infiltrating lymphocytes informs metastatic melanoma outcomes
發(fā)表期刊：Cancer cell
DOI：10.1016/j.ccell.2022.04.005

這項研究關注的是腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL），通過單細胞轉錄組測序結合bulk RNA seq，對TIL進行了系統(tǒng)性的分析，總結了持久存在的駐留記憶TIL細胞的特征，并發(fā)現(xiàn)了和黑色素瘤預后相關的signature。

作者首先利用bulk RNA seq公共數(shù)據(jù)集，分析了多種器官病毒感染后的T細胞亞群，建立了對T細胞在免疫反應中“基準”狀態(tài)的認知，為后續(xù)實驗提供了可對比的基線。

隨后，作者通過單細胞轉錄組測序，對13名轉移性黑色素瘤患者中得到的1500個TIL進行了分析，發(fā)現(xiàn)約2/3的TIL都具有駐留記憶T細胞的特征，并高表達免疫檢查點基因、免疫激活標志物基因，以及組織駐留相關的特征性基因。

作者進一步對比了對PD-1抗體藥物響應和不響應的單細胞黑色素瘤患者樣本，建模發(fā)現(xiàn)：對藥物無響應的患者，樣本中激活的TIL較多；而對藥物有響應的患者，樣本中存在著高比例的記憶/駐留記憶T細胞。

激活的TIL亞群和由病毒或疫苗導致的T細胞狀態(tài)很是相似，同時作者也發(fā)現(xiàn)在其它癌種中也同樣存在，是一個保守的機制。

而持久存在的駐留記憶T細胞，其siganature是潛在的黑色素瘤預后標志物，可以再TCGA中很好地對患者進行分層，將預后好和預后差的患者區(qū)分開來。因此，這個標志物也許未來可以應用于臨床，對患者進行分層管理和治療。

這也是一篇以單細胞測序分析為主的文章。不過，作者創(chuàng)新性地將系統(tǒng)生物學的研究方法與單細胞轉錄組測序相結合，從多個角度進行了全面深入的分析，這是值得參考的思路。同時，作者也通過TCGA數(shù)據(jù)庫，為臨床提供了可能的應用點，這也進一步提升了文章的檔次。

總結：

通過以上的幾篇高分文章，我們可以發(fā)現(xiàn)，它們最明顯的共同特征是：用到了多種的方法論。

前兩篇重實驗驗證，整合了多種多樣的實驗手段，力求多角度提供支持證據(jù)。

后兩篇重生信分析，不僅進行了多種生信分析，同時也通過多組學的方式，豐富了證據(jù)的視角。此外，這兩篇文章都利用TCGA數(shù)據(jù)庫進行了更加深入的挖掘，讓文章更上一層樓——這也是擅長干實驗的老師可以借鑒的方式。

總之，要想文章發(fā)的好，方法多樣不能少。不過，這并不意味著我們必須把已有的實驗方法或生信分析流程全部做個遍，而是可以根據(jù)自己的長項（如更擅長濕實驗中的各種實驗方法，還是更擅長干實驗中的各類生信分析），選擇最能發(fā)揮自身優(yōu)勢的實驗設計。