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創(chuàng)新驅(qū)動(dòng) 卓鑒未來
轉(zhuǎn)錄組2＋3！墨卓平臺(tái)推出單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組解決方案
網(wǎng)站編輯：墨卓生物 │ 發(fā)布時(shí)間：2023-08-15
近日，墨卓生物聯(lián)合及智醫(yī)學(xué)，基于Nanopore平臺(tái)，推出單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組解決方案，實(shí)現(xiàn)高通量、低成本的單細(xì)胞全長(zhǎng)序列分析。該方案為科研人員發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類型、研究細(xì)胞發(fā)育和分化的過程，以及探索各種疾病的發(fā)生機(jī)制提供新的研究利器。
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組作為“入門級(jí)”單細(xì)胞技術(shù)，可以幫助我們了解到細(xì)胞間異質(zhì)性、識(shí)別細(xì)胞類型特異性基因等信息，通常是基于二代測(cè)序平臺(tái)，采用短讀長(zhǎng)的RNA測(cè)序方法。雖然該方法可以定量描述基因表達(dá)水平，但無法精細(xì)區(qū)分基因不同異構(gòu)體。
三代測(cè)序可以解決讀長(zhǎng)較短和無法獲取全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)的局限性，通過二代測(cè)序＋三代測(cè)序聯(lián)用的方法，可以獲得單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本的全長(zhǎng)序列并定位細(xì)胞亞群，實(shí)現(xiàn)基因突變、融合基因、拷貝數(shù)變異、非編碼RNA和可變剪切等研究。單細(xì)胞水平全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的定量和定性分析，能夠?yàn)楦黝惣膊“l(fā)病原因及精準(zhǔn)治療提供更全面的信息。
在制備單細(xì)胞懸液過后，通過MobiNova?-100平臺(tái)對(duì)單細(xì)胞mRNA進(jìn)行捕獲，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，利用同一份cDNA分成兩部分，分別構(gòu)建二代測(cè)序文庫(kù)和三代測(cè)序文庫(kù)。其中，墨卓?jī)?yōu)化了整體的實(shí)驗(yàn)流程，通過二、三代測(cè)序優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，可以獲得更加精細(xì)的細(xì)胞聚類、細(xì)胞注釋、mRNA全長(zhǎng)序列及結(jié)構(gòu)信息。
1. 細(xì)胞懸液制備
根據(jù)不同組織類型，選擇合適的細(xì)胞懸液制備方案。
所制備的細(xì)胞懸液，需要符合以下條件：
l 細(xì)胞數(shù)目：大于1×105個(gè)
l 細(xì)胞活性：大于80%
l 細(xì)胞大小：小于40μm
l 無明顯結(jié)團(tuán)和碎片
2. 獲得全長(zhǎng)cDNA
在MobiNova?-100高通量單細(xì)胞建庫(kù)系統(tǒng)上結(jié)合MobiCube?高通量單細(xì)胞3’轉(zhuǎn)錄組試劑完成單細(xì)胞捕獲，并獲得單細(xì)胞全長(zhǎng)cDNA。
詳細(xì)操作見《MobiCube?高通量單細(xì)胞 3' 轉(zhuǎn)錄組試劑用戶手冊(cè)》。
3. 二代建庫(kù)測(cè)序及分析
a. 吸取一定量的cDNA，參考《MobiCube? 高通量單細(xì)胞 3' 轉(zhuǎn)錄組試劑用戶手冊(cè)》構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)并測(cè)序；
b. 使用MobiVision?生信軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，軟件使用方法見《MobiVision?高通量單細(xì)胞多組學(xué)生信分析軟件使用教程》。
4. Nanopore建庫(kù)測(cè)序及分析
a. 完成步驟3.a之后，保留100-200ng cDNA作為備份，吸取全部剩余cDNA（N ng），使用MobiCube 3’ 轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)試劑盒繼續(xù)擴(kuò)增M循環(huán)（循環(huán)數(shù)計(jì)算方式參考公式：N×2(M-2)=1500）；
b. 純化后獲得1.5-2μg cDNA（若cDNA總量不足1.5 μg，可繼續(xù)補(bǔ)擴(kuò)增），并進(jìn)行Nanopore測(cè)序，建議測(cè)序量為100G/萬細(xì)胞 ；
c. 使用MobibarCheck軟件對(duì)Nanopore測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，軟件下載鏈接和使用說明可點(diǎn)擊文末閱讀原文鏈接獲取。
三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄測(cè)序獲得1.5-2萬個(gè)基因的同時(shí)，轉(zhuǎn)錄本的種類可以達(dá)到5-8萬種，平均每個(gè)基因有3-5條轉(zhuǎn)錄本
左圖為轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度分布，右圖為基因轉(zhuǎn)錄本條數(shù)
PSCA（前列腺干細(xì)胞抗原基因）在單細(xì)胞二代測(cè)序的上皮細(xì)胞亞群中是泛表達(dá)，并未在左側(cè)的惡性上皮中特異性表達(dá)，但是，PSCA的一條轉(zhuǎn)錄本，卻是在左側(cè)的惡性上皮細(xì)胞亞群中特異性表達(dá)。
左圖為二代測(cè)序PSCA基因表達(dá)，右圖為該基因的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)
在本次測(cè)試中，部分樣品可以檢測(cè)出約1萬條融合序列，并均可以歸類到具體亞群中，非常方便查看哪個(gè)亞群更容易發(fā)生融合基因事件。
融合基因在亞群分布比例統(tǒng)計(jì)和亞群映射
以上就是MobiCube? 3’ 單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組解決方案的實(shí)驗(yàn)流程介紹和部分實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)展示。
單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組應(yīng)用范圍廣泛，在識(shí)別細(xì)胞周期、腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性研究、鑒定罕見細(xì)胞類型、免疫細(xì)胞分型、干細(xì)胞分型、疾病分型等領(lǐng)域擁有極大的潛力，墨卓生物聯(lián)合及智醫(yī)學(xué)，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程及數(shù)據(jù)分析環(huán)節(jié)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行了全面系統(tǒng)地優(yōu)化，最大程度保證實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性及數(shù)據(jù)的高效利用，可以幫您從容應(yīng)對(duì)日益深入的科研需求，緊跟科研熱點(diǎn)，從多個(gè)維度解析潛在的生物學(xué)信息。
閱讀原文：http://www.xmtxw.cn/bioinformatics-analysis-software/mobi-bioinfo-toolkit
創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)、卓鑒未來，墨卓生物創(chuàng)立于美國(guó)波士頓，落地中國(guó)浙江，匯集了由國(guó)際一流科學(xué)家和跨國(guó)醫(yī)療器械公司高管等組成的一批優(yōu)秀人才。墨卓致力于用創(chuàng)新微流控和單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)賦能科學(xué)研究與精準(zhǔn)醫(yī)療。目前已經(jīng)成為擁有微流控、測(cè)序、生化、硬件開發(fā)、生信等關(guān)鍵技術(shù)，推出單細(xì)胞測(cè)序與數(shù)字PCR雙技術(shù)平臺(tái)，在液體活檢、伴隨診斷、生命科學(xué)研究等多領(lǐng)域并行發(fā)展的科研+IVD解決方案領(lǐng)跑者