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文獻(xiàn)解讀 | 微生物單細(xì)胞項(xiàng)目案例-香港大學(xué)張彤教授團(tuán)隊(duì)首次繪制活性污泥微生物及耐藥基因單細(xì)胞圖譜
網(wǎng)站編輯：墨卓生物 │ 發(fā)布時(shí)間：2024-10-23
近日，香港大學(xué)張彤教授團(tuán)隊(duì)在Environmental Science and Ecotechnology（IF=14）在線發(fā)表題為“High-throughput single-cell sequencing of activated sludge microbiome”的論文。該研究首次利用微生物單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)繪制了活性污泥樣本中微生物和耐藥基因的單細(xì)胞圖譜，增強(qiáng)了我們對(duì)這一復(fù)雜樣本微生物組中水平基因轉(zhuǎn)移（HGT）的理解，特別是與耐藥基因（ARGs）相關(guān)的HGT，為活性污泥生態(tài)系統(tǒng)提供了新的見(jiàn)解。
文章中使用的微生物單細(xì)胞基因組檢測(cè)技術(shù)為墨卓生物的MobiMicrobe-seq，該技術(shù)曾于2022年發(fā)表于頂尖期刊Science雜志，是一款能夠基于液滴法實(shí)現(xiàn)復(fù)雜微生物樣本超高通量微生物單細(xì)胞基因組測(cè)序的技術(shù)平臺(tái)。基于自主研發(fā)的液滴微流控儀器和配套試劑，在液滴生成、融合等過(guò)程中實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣本中單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的包裹、裂解、全基因組擴(kuò)增、片段化、加標(biāo)簽等精微實(shí)驗(yàn)，助力客戶深入細(xì)胞和菌株水平研究，溯源質(zhì)粒、噬菌體等可移動(dòng)遺傳元件介導(dǎo)的水平基因轉(zhuǎn)移事件，解析微生物間密切的相互作用關(guān)系。
背景
活性污泥（AS）作為污水處理廠廣泛采用的生物處理方法，對(duì)保護(hù)環(huán)境和人類(lèi)健康至關(guān)重要，其包含微生物種群豐富多樣，了解它們的種類(lèi)和作用是優(yōu)化其處理效率的關(guān)鍵。污水處理廠是抗生素耐藥基因交換的關(guān)鍵場(chǎng)所，基于“One Health”概念的提出，需要強(qiáng)調(diào)在污水處理廠開(kāi)展ARG研究的必要性。高通量測(cè)序和宏基因組分析的發(fā)展有助于了解微生物群落，但仍面臨細(xì)胞基因組異質(zhì)性、微生物暗物質(zhì)發(fā)現(xiàn)、無(wú)法準(zhǔn)確地將ARGs和可移動(dòng)遺傳元件（MGEs，如質(zhì)粒和噬菌體）與其特定的單個(gè)宿主細(xì)胞聯(lián)系起來(lái)等挑戰(zhàn)。單細(xì)胞測(cè)序能解決這些問(wèn)題，提供單個(gè)細(xì)胞的遺傳信息，推動(dòng)抗生素耐藥性發(fā)生、MGE-宿主關(guān)系等課題研究發(fā)展。多種技術(shù)促進(jìn)了單細(xì)胞測(cè)序發(fā)展，如分選平臺(tái)和微流控平臺(tái)整合應(yīng)用，但尚未有研究對(duì)活性污泥樣品進(jìn)行高通量單細(xì)胞基因組測(cè)序分析。
研究結(jié)果
單細(xì)胞測(cè)序揭示了AS微生物群落的組成和多樣性
該研究獲得了350 GB的原始測(cè)序數(shù)據(jù)（1.1×109 reads），揭示了15,110個(gè)單細(xì)胞水平的single-amplified genomes (SAGs)和2,454個(gè)物種水平上的SAG bins，污染度比較低（平均0.8%）。研究發(fā)現(xiàn)了27.5%的物種水平SAG bins屬于的新基因組。分析SAG bins多樣性后發(fā)現(xiàn)1,918個(gè)（95.7%）細(xì)菌SAG bins和38個(gè)古菌SAG bins（0.4%）。細(xì)菌主要分布在變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和藍(lán)細(xì)菌門(mén)，相對(duì)豐度分別為25.6%、25.5%和12.8%。其中包括一些AS常見(jiàn)功能菌群，例如 3類(lèi)氨氧化細(xì)菌g_Nitrosomonas和1類(lèi)亞硝酸氧化細(xì)菌o_Nitrospiria。研究者還從中發(fā)現(xiàn)了一些新的固氮微生物類(lèi)群，如Omnitrophota候選細(xì)菌門(mén)，這種細(xì)菌尚未被分離出來(lái)，也知之甚少。總體而言，基于液滴微流控的單細(xì)胞測(cè)序確保了少數(shù)細(xì)菌群體的測(cè)序、組裝和注釋?zhuān)軌蛘业奖缓昊蚪M組裝基因組(MAGs)忽視的一些低豐度微生物，比如3.5%豐度的21個(gè)細(xì)菌門(mén)僅在單細(xì)胞數(shù)據(jù)中存在，體現(xiàn)了單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)在具有挖掘低豐度群體和發(fā)現(xiàn)新分類(lèi)菌群上的巨大潛力。
圖1 微生物單細(xì)胞測(cè)序獲得的SAG bins及物種信息
圖2 SAGs bin的注釋結(jié)果及與宏基因組MAG方法的比較
單細(xì)胞測(cè)序揭示了活性污泥中ARGs、質(zhì)粒和噬菌體的分布，及其與宿主的關(guān)系
（1） ARGs及其宿主的分析
在15,110個(gè)SAGs中檢索到1,137個(gè)ARGs，相當(dāng)于每個(gè)細(xì)胞約0.9個(gè)ARG 拷貝。之前的文獻(xiàn)顯示在WWTP的AS樣本中每個(gè)細(xì)胞有0.3-0.7個(gè)ARGs拷貝。單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果與之前結(jié)果的一致性證實(shí)了單細(xì)胞測(cè)序的準(zhǔn)確度。在本次單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果中，排名前四的ARGs種類(lèi)分別是四環(huán)素、MLS、β-內(nèi)酰胺和多藥耐藥類(lèi)，它們主要在變形菌門(mén)(41.8%)、Patescibacteria菌門(mén)(14.2%)和厚壁菌門(mén)(11.0%)的細(xì)菌中檢出。平均而言，32.8%的ARGs出現(xiàn)在質(zhì)粒上?？紤]到質(zhì)粒的高傳播性，在質(zhì)粒中出現(xiàn)頻率較高的ARGs對(duì)環(huán)境和人類(lèi)有較高風(fēng)險(xiǎn)。此外，相同的AS樣品也進(jìn)行了宏基因組得到ARG譜圖。結(jié)果顯示宏基因組結(jié)果中的ARG拷貝數(shù)為每個(gè)細(xì)胞0.3個(gè)，與單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)相比在耐藥基因類(lèi)別和豐度上有一些差異?？偨Y(jié)而言，單細(xì)胞測(cè)序是揭示更多ARG-宿主菌關(guān)系的有力工具，而這些關(guān)系在宏基因組學(xué)極有可能無(wú)法被檢測(cè)到。
圖3 單細(xì)胞測(cè)序揭示ARGs的宿主關(guān)系
（2）質(zhì)粒及其宿主的分析
該研究中在1,514 SAG bin中注釋到10,450個(gè)質(zhì)粒片段，平均長(zhǎng)度5.5 kb，593個(gè)能夠進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋?zhuān)⒈粍澐譃?1個(gè)菌門(mén)，其中數(shù)量最多的前三個(gè)門(mén)是變形菌門(mén)(193)、Patescibacteria菌門(mén)(82)和厚壁菌門(mén)_A (70)。進(jìn)一步分析這些質(zhì)粒在細(xì)菌中的關(guān)聯(lián)關(guān)系，在有物種注釋信息的273 SAG bins中找到了12,819個(gè)對(duì)應(yīng)關(guān)系，這些結(jié)果充分證明了質(zhì)粒作為環(huán)境中典型的MGEs和微生物中HGT的關(guān)鍵成分對(duì)抗菌素耐藥性傳播的關(guān)鍵作用，也體現(xiàn)了微生物單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)在還原質(zhì)粒與細(xì)菌細(xì)胞歸屬關(guān)系以及解析細(xì)菌間潛在質(zhì)粒轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)。
圖4 單細(xì)胞測(cè)序揭示質(zhì)粒的宿主關(guān)系
（3）噬菌體及其宿主的分析
作者在617個(gè)SAG bins中獲得了總共1,343個(gè)噬菌體contigs，包括563個(gè)細(xì)菌SAG bins、5個(gè)古菌SAG bins和49個(gè)未分類(lèi)SAG bins。有尾噬菌體綱在Shatin wastewater treatment plants (ST WWTPs)中具有優(yōu)勢(shì)地位，只有7.9%的噬菌體能夠在目水平上被注釋?zhuān)@表明AS系統(tǒng)的噬菌體挖掘潛力巨大，并且迫切需要擴(kuò)大現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)多樣性。
近年來(lái)，噬菌體引起的ARG傳播被認(rèn)為是導(dǎo)致新的多重耐藥性菌株出現(xiàn)的重要機(jī)制。本研究中檢測(cè)到五種噬菌體攜帶的ARGs，包括MLS (2)、四環(huán)素(1)、多藥耐藥(1)和氨基糖苷類(lèi)(1)。作為一種典型的MGE，噬菌體在原核生物進(jìn)化中起著重要的作用，該研究識(shí)別了可以感染不同宿主的噬菌體，并且鑒定了184組宿主-噬菌體關(guān)系，其中59組在宿主的不同分類(lèi)水平上顯示出保守性。一些噬菌體表現(xiàn)出廣譜的宿主范圍，例如，Patescibacteria菌門(mén)的噬菌體也可以侵染其他五個(gè)門(mén)的宿主，如變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)。微生物單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)精準(zhǔn)還原單個(gè)細(xì)菌中包含的噬菌體信息，能夠深入了解噬菌體對(duì)細(xì)菌的影響，尤其是具有多個(gè)宿主的噬菌體，對(duì)于WWTPs等環(huán)境中微生物群落的調(diào)控具有重要意義。
圖5 單細(xì)胞測(cè)序揭示噬菌體的宿主關(guān)系
結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序和宏基因組學(xué)揭示AS微生物組的復(fù)雜性
結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序和宏基因組學(xué)的聯(lián)合分析方法可以獲得更好的基因組得率和更準(zhǔn)確的微生物種群分辨率。2,454個(gè)SAG bins中有812個(gè)基因組的質(zhì)量通過(guò)MAGs的整合輔助得到改善。一方面，基因組的平均完整度有所提高，使得中高質(zhì)量的基因組數(shù)目增多；但另一方面，污染度增加導(dǎo)致一些完整度較高的基因組被判定為中質(zhì)量基因組。因此，如何利用算法來(lái)提高基因組的完整性，并確保低污染水平，將是后續(xù)分析方法開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題。另有98個(gè)之前“未分類(lèi)”的SAG bins成功被注釋到20個(gè)細(xì)菌門(mén)。此外，聯(lián)合分析增加了SAG bins中ARGs、質(zhì)粒和噬菌體的宿主關(guān)系信息的獲?。侯~外注釋到了22個(gè)ARGs, 60個(gè)質(zhì)粒片段和51個(gè)噬菌體片段。以上結(jié)果表明，MAG和SAG在完善基因組信息方面具有互補(bǔ)作用。SAG可以確定正確的組裝結(jié)果，并提供更多MAG不同細(xì)胞間異質(zhì)性的細(xì)節(jié)。這兩種測(cè)序方法的結(jié)合可以從宏觀和微觀兩個(gè)角度全面揭示微生物群落。作者也強(qiáng)調(diào)需要開(kāi)發(fā)更加全面和適合的算法來(lái)整合兩種組學(xué)的數(shù)據(jù)。
圖6 單細(xì)胞測(cè)序和宏基因組學(xué)的互補(bǔ)結(jié)果
通過(guò)上述研究成果，我們可以看到了微生物單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)在基因組異質(zhì)性挖掘、少數(shù)群體驗(yàn)證、宿主-MGE（可移動(dòng)遺傳元件）關(guān)系鑒定等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。特別是針對(duì)抗生素抗性基因轉(zhuǎn)移的探索，不僅更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)污水處理過(guò)程中的耐藥基因監(jiān)測(cè)，也揭示了MobiMicrobe微生物單細(xì)胞基因組技術(shù)在環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。這對(duì)于在“同一個(gè)健康”方法下保護(hù)公共衛(wèi)生至關(guān)重要。除了對(duì)改進(jìn)監(jiān)測(cè)和選擇策略鋪平道路外，本研究也證實(shí)了，單細(xì)胞測(cè)序和宏基因組的聯(lián)合分析有助于提升微生物群落信息的完整性和準(zhǔn)確性。相信隨著該技術(shù)平臺(tái)在樣本預(yù)處理、生信算法開(kāi)發(fā)等方面的逐漸優(yōu)化完善，能夠更好地繪制不同微生物組的圖譜、探究不同條件下微生物種群的動(dòng)態(tài)變化及其對(duì)干擾的響應(yīng)，助力微生物組學(xué)研究的全新未來(lái)！
產(chǎn)品推薦
基于MobiMicrobe-seq技術(shù)的微生物單細(xì)胞基因組產(chǎn)品
墨卓生物MobiMicrobe-seq技術(shù)發(fā)表在《Science》雜志，搭載于MobiNova?-M1儀器和配套試劑盒，集成了多種液滴微流控操作技術(shù)和定制開(kāi)發(fā)的生物信息學(xué)分析方法，不需要培養(yǎng)即可從復(fù)雜微生物群落中獲取成千上萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞微生物的基因組信息，并組裝出高質(zhì)量的菌株水平基因組，從而能夠在不損失分辨率或廣泛物種適用性的基礎(chǔ)上探究微生物群落的基因組。該方法應(yīng)用面廣泛，可用于具有復(fù)雜微生物群落的樣本，如糞便、土壤和海洋等，在微生態(tài)研究中具有極大的市場(chǎng)應(yīng)用潛力。
墨卓生物是一家以微流控芯片技術(shù)和自主創(chuàng)新基因檢測(cè)為核心，擁有高通量單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序、微生物單細(xì)胞測(cè)序、單細(xì)胞分選等平臺(tái)型產(chǎn)品線，集儀器、芯片、試劑、生信軟件的研發(fā)、生產(chǎn)、銷(xiāo)售于一體的整體解決方案供應(yīng)商。公司創(chuàng)始人團(tuán)隊(duì)來(lái)自哈佛大學(xué)，研發(fā)和運(yùn)營(yíng)團(tuán)隊(duì)有著數(shù)十年跨國(guó)企業(yè)從業(yè)經(jīng)驗(yàn)，由世界一流的科學(xué)家、行業(yè)資深前輩擔(dān)任顧問(wèn)。墨卓生物致力于成為生命科學(xué)、精準(zhǔn)醫(yī)療、農(nóng)林業(yè)育種等研究領(lǐng)域的上游科研儀器開(kāi)發(fā)領(lǐng)跑者。